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　　【摘要】 目的：探讨生蚝提取物对高温致神经管畸形中凋亡细胞的保护作用。方法：取36只金黄地鼠孕鼠，随机分为4组：高温对照组和生蚝保护Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，用核固红 -结晶紫染色方法，观察各组鼠胚的神经上皮和周围间充质细胞的凋亡状况。用免疫组织化学法和图像分析技术对各组鼠胚的神经上皮和周围间充质细胞凋亡相关蛋白Caspase3的表达进行定性、定位和半定量观察。结果：①高温后8h、16h，对照组鼠胚神经上皮和周围间充质细胞凋亡数较多，生蚝保护组细胞凋亡数明显减少(P<0.05, P<0.01);②高温后8?h、16?h，对照组鼠胚神经上皮和周围间充质内可见Caspase3阳性表达细胞，生蚝保护组的相应部位 Caspase3呈弱阳性或阴性表达(P<0.05)。结论：生蚝提取物对高温致神经管畸形中神经上皮及周围间充质的凋亡细胞具有一定的保护作用。

　　【关键词】 高温 生蚝 金黄地鼠 细胞凋亡

　　A Protective effect of oyster extract on apoptotic cells in neural

　　tube defect induced by hyperthermia

　　SONG Haiyan, WU Yuling, ZHANG Yanping

　　(Department of Histology and Embryology, School of Medicine, Shandong University,

　　Jinan 250012, Shandong, China)

　　[ABSTRACT] Objective： To explore the protective effect of oyster extract on apoptotic cells in neural tube defect(NTD) induced by hyperthermia. Methods： Thirtysix pregnant golden hamsters were divided into 4 groups at random: a control group subjected only to hyperthermia and oyster Ⅰ,　Ⅱ and Ⅲ groups, with oyster extract. The nuclear fast redgentian violet staining method was used to observe the histological and the quantitative alteration of apoptosis cells during the development of the neural tube in each embryo. An immunohistochemistry method and image analysis were employed to explore the expression of Caspase3 in the neuroepithelial and mesenchyme cells of each embryo. Results： ① At 8 and 16 hours after hyperthermia, compared with the control groups, the apoptosis index of neuroepithelial and mesenchymal cells in the oystertreated groups decreased　(P<0.05, P<0.01);　②　At 8 and 16 hours after hyperthermia, the expression of Caspase3 in the neuroepithelial cells was weaker in the oystertreated than in the control groups (P<0.05). Conclusion: Oyster extract has a possible protective effect on the apoptosis cells of neuroepithelia and mesenchyme in NTD induced by hyperthermia.

　　[KEY WORDS] Hyperthemia; Oyster; Hamster; Apoptosis

　　神经管畸形(neural tube defects, NTD)是较为常见、且危害较严重的先天畸形，是影响我国优生率的主要原因。高温是常见的物理致畸因子，可导致多种先天畸形，也是引起神经管畸形的主要环境因素[1]。动物实验显示[2]，高温可促进胚胎神经上皮和周围间充质的细胞凋亡，导致神经管延迟闭合或不闭合，从而造成无脑、露脑、脑脊膜膨出等神经管畸形。生蚝为海洋贝类动物，其提取物中富含牛磺酸和锌，这些物质具有抗氧化及清除自由基的作用，可保护组织免受氧化剂和自由基的损伤，还可以拮抗缺血心肌细胞的凋亡，对受损的细胞有保护作用。据报道[3,4]，牛磺酸和锌还可以促进早胚发育，具有抗致畸作用。若它们能拮抗高温致神经管畸形中的细胞凋亡，即可拮抗高温致神经管畸形的发生。因此，我们设计了该项实验。本实验在我室已建立的高温致金黄地鼠NTD的动物模型上，通过生蚝提取物干预，采用核固红-结晶紫和免疫组织化学染色方法，观察鼠胚神经上皮和周围间充质细胞的凋亡状况及凋亡相关蛋白Caspase3在神经上皮的表达变化，旨在探讨生蚝提取物对高温致神经管畸形中凋亡细胞的保护作用，为指导人们利用天然食物减少先天性缺陷提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 药品及试剂 生蚝提取物购于蓬莱市海洋生物有限公司(用前以生理盐水配制成所需浓度)。 兔抗Caspase3血清、SABC 试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程有限公司。粘片剂APES购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2 实验动物及其处理 成年未经产雌性金黄地鼠(购于北京实验动物研究中心)36只，体重(100±10)g,鼠颗粒饲料喂养，常规饮水。于晚7 9时与雄鼠1∶1合笼，视其交配。交配者次日定为孕1天。将孕鼠随机分为对照组和实验组：对照组6只，将孕鼠于孕8天下午3时置42?℃水浴 20?min;实验组又分3组，分别为生蚝保护Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，每组10只孕鼠。Ⅰ组孕鼠从孕1天到孕8天，每天随饮水口服浓度为40?mg/ml生蚝提取液10?ml，剂量为4?g/kg。Ⅱ、Ⅲ组孕鼠从孕5天到孕8天每天分别灌服浓度为1?g/ml的生蚝提取液0.5?ml和1?ml，剂量分别为5?g /kg和10?g/kg。所有孕鼠均按与对照组相同的方法进行高温处理。

　　1.3 标本制备 将对照组和各生蚝保护组分别分为2个小组，前者每小组3只，后者每小组5只，分别于水浴后8?h、16?h麻醉处死，取出妊娠子宫，部分标本固定于4%多聚甲醛，部分标本固定于bouins固定液，常规石蜡包埋，连续切片(厚5?μm)，裱片于涂有APES的载玻片上，置45?℃温箱内烤干备染。

　　1.4 核固红-结晶紫染色及观察 光镜下，观察各组鼠胚神经管头端及周围间充质细胞的凋亡现象。分裂间期的细胞核染为红色，分裂期细胞染色体和凋亡的细胞核染为紫蓝色。将每个胚胎头部的切片各取5张分别计数神经上皮及周围间充质的细胞凋亡数，再换算成凋亡指数(换算方法如下)，然后将实验组和对照组的凋亡指数进行方差分析。

　　神经上皮细胞凋亡指数=细胞凋亡数(个)神经管游离面长度(mm)

　　间充质细胞凋亡指数=细胞凋亡数(个)间充质面积mm2

　　1.5 免疫组织化学染色及观察 切片脱蜡入水;3%过氧化氢/甲醇封闭内源性的过氧化物酶;0.01?mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)热抗原修复;5%BSA封闭室温 20?min;滴加兔抗Caspase3血清(1∶100)4?℃冰箱过夜;滴加生物素化羊抗兔抗体，20 37?℃ 20?min;滴加SABC复合物，20 37?℃ 20?min;DAB显色室温10?min。阳性结果呈棕黄色反应。空白对照以PBS代替-抗。将免疫组化结果投射到图像分析仪上，经减除背景，测量神经上皮细胞的光密度值(OD值)，将实验组和对照组鼠胚神经管头部相应部位的平均光密度值和标准差作方差分析。

　　2 结 果

　　2.1 核固红-结晶紫染色结果 见图1 图3。高温处理后8?h，神经上皮排列不整齐，凋亡细胞数目较多，周围间充质凋亡细胞较多(图 1A)。高温后16?h，神经上皮和周围间充质细胞凋亡数明显增多。与对照组相比，生蚝保护Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组鼠胚神经上皮及其周围间充质在高温处理后 8?h(图 1B)、16?h细胞凋亡数目明显减少,细胞凋亡指数明显下降(P<0.05,P<0.01)。

　　2.2 Caspase3免疫组织化学染色结果 见图4，图5。镜下可见Caspase3阳性细胞散在于神经上皮及间充质内，有的细胞质内有棕黄色颗粒，有的细胞质与细胞核内均可见棕黄色颗粒。对照组高温后8?h、16?h鼠胚神经上皮中可见少量Caspase3阳性表达细胞(图4A)，各实验组中神经上皮细胞中Caspase3呈弱阳性或阴性表达(图4B)。图像分析结果显示，各实验组Caspase3阳性神经上皮细胞OD值明显低于相应对照组(*P<0.05,**P<0.01)。高温后 8?h鼠胚横切面神经上皮和间充质的凋亡细胞(核固红-结晶紫染色 ×400)

　　3 讨 论

　　细胞凋亡是组织中某些细胞受其内在基因的调节，通过主动的生化过程而自杀死亡的生物现象。胚胎发育过程中，在特定的时间和部位发生控制性细胞死亡，若这种精确调节的细胞死亡程序改变，则可能引起多种先天畸形。

　　动物实验显示，高温可促进神经上皮及其周围间充质细胞的凋亡，使成活细胞数减少，从而导致神经管延迟闭合或不闭合，最终形成无脑、露脑、脑脊膜膨出等神经管畸形。实验证明，胚胎神经管畸形可由胚胎的DNA损伤引起，而DNA损伤与机体的过氧化状态有关。

　　生蚝提取物中含有丰富的牛磺酸，其含量高达6.37%[5]。牛磺酸是一种人体必需的非蛋白质氨基酸，具有很重要的生物活性。牛磺酸在脑内含量丰富，体外实验证明，它能明显促进神经系统的生长发育和细胞增殖、分化。动物实验研究表明[6]，牛磺酸具有加强清除氧自由基和减少脂质过氧化反应的能力，可拮抗缺血心肌细胞的凋亡，对受损伤的细胞有保护作用。此外，生蚝中还含有丰富的铁、锌、硒等矿物质和微量元素,特别是锌和硒更为丰富。近年研究表明[7]，锌参与调控细胞增殖与凋亡，从而保持细胞数量在体内的稳定。Cohen等[8]在糖皮质激素诱导小鼠胸腺细胞凋亡动物模型中发现，凋亡胸腺细胞DNA断裂为 200?bp及其整倍数的小片段，但加入50 500?μmol/L Zn2+则可以阻断DNA片段化。

　　本实验通过核固红-结晶紫染色方法，检测生蚝提取物对高温处理后鼠胚神经上皮及周围间充质细胞凋亡的影响，结果显示，对照组高温后8?h和16?h鼠胚神经上皮及周围间充质中凋亡细胞较多，与马金龙等[2]的研究结果一致。生蚝提取物保护组与对照组相比，在高温后8?h和16?h鼠胚神经上皮及周围间充质中细胞凋亡数明显减少，提示生蚝提取物可抑制高温致神经管畸形中神经上皮及周围间充质细胞的凋亡。

　　Caspase是一组具有相似的氨基酸顺序及二级结构的半胱氨酸蛋白酶。Caspase家族在细胞凋亡的过程中起着关键性作用。Caspase家族成员中,Caspase3与凋亡的关系最为密切，参与多种因素诱导的细胞凋亡[9]。正常情况下，细胞中的Caspase3无活性，以酶原形式存在。当细胞受到刺激时，它被级连反应激活，进而诱导细胞发生凋亡。细胞凋亡的某些特征性标志，如染色质聚集，DNA片段化等均与Caspase3有着直接关系[10]。

　　本实验在检测高温后凋亡细胞数量变化的同时，采用免疫组织化学方法及图像分析技术，对高温处理后对照组和生蚝保护组鼠胚神经上皮及周围间充质细胞中 Caspase3的表达状况进行检测。结果表明，生蚝干预组鼠胚神经上皮相应部位细胞中Caspase3的表达明显低于高温对照组，差异显著。这进一步提示，生蚝提取物对高温引起的凋亡细胞具有一定的保护作用。实验结果显示，高温后8?h、16?h，Caspase3阳性细胞数比同时用核固红-结晶紫染色检测到的细胞凋亡数明显减少，说明Caspase3的出现早于凋亡细胞的出现，提示Caspase3参与了高温致神经管畸形中的细胞凋亡。这与我们实验室以前的研究结果一致[2]。

　　本实验结果证明，生蚝提取物对高温所致金黄地鼠神经管畸形中神经上皮的细胞损伤具有一定的保护作用，这可能与提取物中所含牛磺酸及锌等物质的清除自由基、减少机体的过氧化状态，从而减少细胞的DNA损伤有关，其确切作用机制尚待进一步探讨。